نکات عملی روش لومینسانس

لومینسانس فرآیندی است که در آن ماده از حالت برانگیخته به حالت پایه آمده و انرژی خود را به صورت تابش آزاد می‌کند. در شیمی بیشتر به فرآیندهای فوتولومینسانس (فلورسانس و فسفرسانس) و همچنین فرآیندهای شیمی‌لومینسانس (Chemiluminescence) اهمیت داده می‌شود اندازه گیری لومینسانس تابش یافته از ماده می‌تواند منجر به کسب اطلاعات تجزیه‌ای از کل سامانه گردد. برای این منظور طیف‌سنج‌های (Spectrometers) لومینسانس طراحی و به کارگرفته می‌شوند. امروزه طراحی اسپکترومتر های مبتنی بر لومینسانس به نحوی انجام می شود که دستگاه قابلیت کاربرد در زمینه فلورسانس، فسفرسانس و شیمی لومینسانس را دارا باشد. این دستگاه ها تطبیق پذیر و قابل اعتماد بوده و کاربردهای وسیع در تجزیه های زیستی (Bioanalytical Applications) دارند. برای مطالعه گسترده تر در خصوص پدیده لومینسانس پیشنهاد می‌گردد تا به مقاله اول این مبحث با عنوان “معرفی فرآیندهای لومینسانس و فوتولومینسانس” مراجعه گردد. هرچند تقریبا تمامی گونه‌ها نور را در فرکانس‌(های) خاصی جذب می‌کنند، تنها گونه های خاصی توانایی نشر لومینسانس را دارند. ترکیبات لومینسانس دهنده برخی گونه‌های مولکولی و دسته‌های خاصی از نانومواد را شامل می شود. فرآیند تابش لومینسانس در این ترکیبات می تواند جهت بررسی سیستم و یا اندازه گیری غلظت مورد استفاده قرار گیرد. همچنین این ترکیبات در بسیاری از موارد به عنوان نشانه (Label) جهت نشان دار کردن مولکول‌ها یا ذرات شیمیایی دیگر به کار می‌روند. با این روش می‌توان بسیاری از سامانه‌هایی را که به طور عادی در لومینسانس غیرفعالند، مورد مطالعه و کاربرد قرار داد.

طراحی دستگاه های لومینسانس(Luminescence Instrumentation)

طراحی طیف‌سنج‌ها (Spectrometers) و فوتومترهای لومینسانس (Luminescence Photometers) بر اساس توان تابشی بسیار پایینی است که توسط آشکارساز(Detector) دیده می شود (معمولا به اندازه پیکووات یا کمتر). در مقابل، توان تابشی عبوری در اندازه گیری های مبتنی بر جذب ملکولی (Molecular Absorption Spectroscopy) در گستره ۱ تا ۱۰۰۰ نانو وات می باشد. سیگنال لومینسانس مربوط به آنالیت مورد نظر باید از سیگنال زمینه (Background)، سیگنال تاریک و نوفه (Noise) تشخیص داده شود. اجزای اصلی برای اندازه گیری های فوتولومینسانس در شکل (۱) نشان داده شده است. منبع (Excitation Source)، انتخابگر طول موج برانگیختگی (Excitation Wavelength Selector) و قطعات اپتیکی مربوطه، ویژگی های نور اولیه ای را که به نمونه برخورد می کند تعیین می کنند. ویژگی های نور ثانویه یا نشری که توسط آشکارساز دیده می شود توسط انتخابگر طول موج نشری(Emission Wavelength Selector) مشخص می گردد. در اغلب دستگاه های لومینسانس، نشر نور به طور معمول نسبت به محور برانگیختگی یا جذب در زاویه ۹۰ درجه نسبت به نور منبع اندازه گیری می شود. برای اندازه گیری های شیمی لومینسانس (Chemiluminescence) نیازی به منبع برانگیختگی و انتخابگر طول موج برانگیختگی نخواهد بود.

شکل ۱- دیاگرام اسپکتروفوتومتر لومینسانس مولکولی. نور از منبع برانگیختگی به انتخابگر طول موج برانگیختگی برخورد کرده و سپس یک طول موج خاص که قرار است به سل نمونه برخورد کند جدا می شود. بخشی از نور نشر شده در زاویه ۹۰ درجه نسبت به محور برانگیختگی به انتخابگر طول موج نشری برخورد می کند. توان نور لومینسانس شده در گستره طول موج نشری به وسیله آشکارساز دیده می شود. سیگنال اشکارساز پردازش شده و نهایتا به نمایش در می آید.

فلورومتری (Fluorometry) به اندازه گیری های فلورسانس اطلاق می شود که توسط فلورومتر (Fluorometer) و یا اسپکتروفلورومتر (Spectrofluorometer) انجام شده باشند. در صوررتی که انتخابگر طول موج صافی (Filter) باشد، به دستگاه حاصل فلورومتر گفته می شود. در اسپکتروفلورومتر ها از تکفام‌ساز(Monochromator) به عنوان انتخابگر طول موج استفاده می گردد. در دستگاه های ترکیبی (هیبریدی) از یک صافی و یک تکفام ساز همزمان استفاده شده است که به آن ها نیز اسپکتروفلورومتر گفته می شود. در معمول ترین پیکربندی از دستگاه های ترکیبی، برای جداسازی طول موج برانگیختگی از تکفام ساز و برای جداسازی طول موج نشری از صافی استفاده می شود. نکته قابل توجه این است که اصطلاحات فلوریمتر و فلوریمتری در اروپا رایج است. برای اندازه گیری های فسفرسانس همیشه از اصطلاح فسفریمتری (Phosphorimetry) استفاده می شود. در این مقاله از لفظ فلورومتری و فسفریمتری که در آمریکا رایج است استفاده می کنیم. اجزاء تشکیل دهنده یک دستگاه طیف سنجی (جزئیات دستگاهوری) به تفصیل در مقاله دیگری توضیح داده خواهند شد.

ترکیبات لومینسانس دهنده

۱-۳- ترکیبات مولکولی لومینسانس دهنده
ترکیبات مولکولی لومینسانس دهنده به سه دسته کلی تقسیم بندی می شوند

۱) ترکیبات آلی: هیدروکربن های آروماتیک (نفتالین، آنتراسن، فنانترن و غیره)، فلورسین، رودامین ها، پلی ان ها، دی فنیل پلی ان ها، آمینواسیدها (تریپتوفان، تیروزین و فنیل آلانین) و غیره.
۲) ترکیبات معدنی: یون اورانیل (⁺UO₂)، بلورها (یاقوت) Al₂O₃/Cr³⁺، ZnSe، ZnS،CdS ، یون های لانتانید ( ⁺Tb³و ⁺Eu³)

۳) ترکیبات فلزی-آلی (Organometallic Compounds) : ترکیبات روتنیوم (Ru(bipy)₃)، کمپلکس های حاوی یون های لانتانید، کمپلکس های حاوی معرف های کیلیت کننده ای (Chelating Agent) که تولید فلورسانس می کنند از جمله ۸-هیدروکسی کینولین که معمولا اکسین نامیده می شود و غیره.

نانومواد لومینسانس دهنده
ترکیبات لومینسانس دهنده در مقیاس نانو وابسته به مواد تشکیل دهنده به طور کلی در چهار دسته قرار می گیرند:

نقاط کوانتومی نیمه هادی
خوشه های فلزی در ابعاد نانو
نانو مواد مختلط شده (Dopped) با فلزات
کامپوزیت ها و هیبرید های آلی-معدنی.

نقاط کوانتومی نیمه هادی همانند کادمیم سلنید (CdSe) و کادمیم تلورید (CdTe) جزء پرکاربردترین نانومواد لومینسانس دهنده می باشند. نکته مهمی که در مورد این مواد باید مورد توجه قرار گیرد این است که اندازه نانوذره باید به دقت کنترل شود، ساختار پوسته-هسته و همینطور نوع ماده پوشاننده (Capping Agent) یا پایدارکننده (Stabilizer) باید مشخص باشد. به طور معمول نشر نقاط کوانتومی نیمه هادی به صورت گسسته است که اصطلاحا به این پدیده چشمک زدن (Blinking) می گویند. تا کنون انواع مختلفی از نقاط کوانتومی از گروه‌های II-VI، III-V و IV-IV با کارایی کوانتومی بسیار بالا (۹۰-۶۰ درصد) تهیه شده اند که نشر آن ها کل ناحیه طیفی از ماوراء بنفش تا مادون قرمز را پوشش می دهد. با توجه به اثر اندازه کوانتومی (Quantum Size Effect)، در این ترکیبات رنگ های مختلفی در طول موج نشری حاصل می شودکه تنها با تغییر اندازه نانو ذره امکان پذیر است. در مقابل، نقاط کوانتومی نیمه هادی مشکلاتی دارند. از این جمله سمیت آن هاست و اینکه مواد تشکیل دهنده آن ها جزء عناصر کمیاب و گران قیمت کره زمین می باشند. به علاوه حساسیت نقاط کوانتومی نیمه هادی به هیدرولیز و اکسیداسیون کاربرد آن ها را محدود می کند. رزونانس پلاسمون سطحی در خوشه های فلزی (عمدتا طلا و نقره) منجر به نشر نور در ناحیه مرئی از این ترکیبات می شود. وابستگی طول موج نشر نور به اندازه ذره در مورد این ترکیبات نیز دیده می شود. بر خلاف نقاط نیمه هادی و کربنی و همینطور نانوخوشه های فلزی، نانومواد مختلط شده (Dopped) با فلزات (NaYF₄:Er,Yb) و کامپوزیت ها و هیبریدهای آلی-معدنی دسته دیگری از نانو مواد لومینسانس کننده هستند که نشر نور در آن ها مستقل از اندازه بوده لذا سنتز آن ها راحت تر می باشد.در مقابل، نشر این ترکیبات منحصر به یک طول موج خاص می باشد. نانوکامپوزیتهای آلی-معدنی به طور معمول از یک رنگ آلی لومینسانس کننده (ردامین و فلورسین) تشکیل شده اند که درون یک ماتریس معدنی قرار می گیرند. ماتریس معدنی مورد استفاده در این ترکیبات عمدتا سیلیکا و یا کلسیم فسفات می باشد. مشکل این ترکیبات این است که ملکول های رنگ جذب سطحی شده بر ماتریس معدنی امکان کنده شدن دارند. برای رفع این مشکل، ملکول های رنگ را با روش های سنتز میکروامولسیون درون محفظه ای کپسول مانند از ماتریس معدنی قرار می دهند. بر خلاف نانو کامپوزیت ها، در هیبریدهای آلی-معدنی رنگ لومینسانس کننده جزء اصلی شبکه جامد محسوب می شود لذا هر نانوذره نشر نور را به صورت نقطه ای انجام میدهد..

تکنولوژی های جدید در فلورسانس

تحریک با فوتون های چندگانه
در طول چند سال اخیر پیشرفت های جدیدی مبتنی بر کاربرد فلورسانس در زمینه های مختلف حاصل شده است. این تکنولوژی های جدید به سرعت فراگیر شده و در حال گسترش اند. یکی از آن ها، تحریک توسط دو یا چند فوتون با طول موج هایی بلندتر از طول موج نشری است. فلورسانس معمولا توسط تحریک فلوروفور (قسمت مولکولی عامل ایجاد فلوروسانس) با یک فوتون تک صورت می گیرد. لیزرهای پالسی با پهنای پالس در حد فمتوثانیه قادرند فلوروفورها را با تحریک توسط دو یا چند فوتون در حالت برانگیخته قرار دهند. استفاده از این لیزرها آسان بوده و در میکروسکوپ ها نیز کاربرد دارند. در صورتی که شدت نور لیزر زیاد باشد، یک فلوروفور می تواند به طور همزمان دو فوتون با طول موج های بلند را جذب کرده و به اولین حالت یکتایی برانگیخته شود. این فرایند به شدت نور وابسته است و تنها در نقطه کانونی پرتو لیزری اتفاق می افتد[۴]. میکروسکوپ های مبتنی بر فلورسانس با فوتون های چندگانه، از منابع تحریک با انرژی پایین تر ( معمولا در ناحیه مادون قرمز یا مادون قرمز نزدیک) استفاده می کنند. اشعه مادون قرمز در لیزرها به دلایلی از جمله: ۱) عمق نفوذ بیشتر، ۲) کاهش پدیده خودجذبی و فلورسانس خودبخودی بافت های بدن، ۳) کاهش آسیب رسانی به بافت های بدن و ۴) متمرکز شدن نور در یک نقطه خاص، به خصوص برای آنالیز در محیط زنده مناسب است.
Fluorescence Correlation Spectroscopy

این تکنیک برای اولین بار در سال ۱۹۷۰ معرفی گردید و به منظور بررسی رفتار ملکول های زیستی در غلظت های بسیار کم در محلول به کار گرفته شد. توسط این روش می توان اطلاعاتی در خصوص نفوذ ذره، سینتیک شیمیایی، واکنش هیبرید شدن (Hybridization Reaction) و تراکم مولکولی (Molecular Aggregation) به دست آورد. در این روش نور لیزر به حجم بسیار کوچک در حد فمتولیتر -که به آن حجم مشاهده شده (Observed Volume) نیز می گویند- از محلولی که درون یک Cuvette قرار داده شده متمرکز می شود. حرکت برونی (Brownian Motion) ملکول های فلورسانس کننده ای که از درون این حجم بسیار کوچک عبور می کنند منجر به نوسانات شدت فلورسانس می شود. این نوسانات می تواند به دلیل تغییر تعداد فلوروفورها و یا تغییر بازده کوانتومی فلورسانس در نتیجه انجام یک واکنش شیمیایی باشد. دو کمیت بسیار مهم از آنالیز نوسانات شدت فلورسانس در حجم مشاهده شده بدست می آید که عبارتند از: ۱) تعداد ملکول ها در حجم مشاهده شده و یا به عبارتی غلظت آن ها و ۲) ضریب نفوذ. هر تغییری در ضریب نفوذ ذره در محلول می تواند به دلیل تغییر اندازه یا شکل ذره و یا تغییر در ویسکوزیته محلول صورت گرفته باشد و هر تغییری در غلظت ملکول ها ممکن است به دلیل تجمع (Association) و یا تفکیک (Dissociation) آن ها باشد. بسیاری از محققان معتقدند که این تکنیک برای بررسی سرعت نفوذ پروتئین به درون سلول های زنده بسیار مفید است.

آشکار سازی مولکول های منفرد
مشاهده مولکول های منفرد توسط یک روش، نمایانگر دستیابی به بالاترین حساسیت ممکن در روش است. در اکثر این آزمایشات فلوروفور بر روی یک سطح تثبیت می شود. این فلوروفورها می بایست کارایی کوانتومی بالایی داشته و در برابر نور پایدار باشند. این تکنولوژی به سرعت در حال پیشرفت است به طوری که علاوه بر شدت فلورسانس می توان طول عمر مولکول های تک را نیز اندازه گرفت. بدون کمک این تکنولوژی تقریبا تمام آزمایشات خواص میانگین تعداد زیادی از مولکول ها را نشان می دهند، در حالی که اگر امکان بررسی ملکول ها به صورت مجزا وجود داشته باشد می توان به جزئیات بسیار ظریفی از مولکول ها مثل تغییر کنفورماسیون یک مولکول پی برد.

نتیجه گیری

دستگاه های اندازه گیری پدیده لومینسانس از بخش های منبع، انتخاب‌گر طول موج برانگیختگی، انتخاب‌گر طول‌موج نشری، سل نمونه، آشکارساز و پردازنده تشکیل شده است. دستگاه هایی که از صافی استفاده می‌کنند با نام فلورومتر و دستگاه‌هایی که از تکفام‌ساز استفاده می‌کنند، اسپکتروفلورومتر می‌گویند. همچنین به تکنیک هایی که در آنها پدیده فسفرسانس اندازه گیری می‌شود فسفریمتری می گویند.
برخی ترکیبات آلی همچون فلورسین ورودامین، برخی ترکیبات معدنی مثل اورانیل و برخی بلورها و نهایتا برخی از کمپلکی‌های آلی فلزی جزء ترکیبات معدنی فلوروسانس کننده هستند. نقاط کوانتمی نیمه‌هادی و کربنی، خوشه‌های فلزی در ابعاد نانو، نانومواد مختلط شده با فلزات و همچنین برخی کامپوزیت های هیبریدی آلی-معدنی از دسته نانومواد لومینسانس کننده هستند.